實(shí)驗(yàn)方法原理

這是一種快速簡便提取植物總DNA的方法。先將新鮮的葉片在液氮中研磨，以機(jī)械力破碎細(xì)胞壁，然后加入十六烷*基溴化銨分離緩沖液，使細(xì)胞膜破裂。同時(shí)將核酸與植物多糖等雜質(zhì)分開（十六烷*基溴化銨，簡稱CTAB，是一種陽離子去污劑），再經(jīng)氯-仿-異戊醇抽提去除蛋白，即可得到適合于酶切的DNA。

實(shí)驗(yàn)材料 幼嫩的植物材料

試劑、試劑盒 液氮 CTAB抽提緩沖液 NaAC Tris-HCl  EDTA 氯-仿 異戊醇 TE buffer

儀器、耗材 瓷研缽 離心管 離心機(jī)

一、實(shí)驗(yàn)試劑及材料

1.  材料：幼嫩的植物材料0.5g左右。

2.  試劑：液氮，CTAB抽提緩沖液：2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide， 十六烷基*基溴化銨)，1%β-巰基乙醇 1.4mol/L Nacl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-Hcl pH8.0，3M NaAC，50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA，氯-仿：異戊醇（24:1），異丙醇 ，70％乙醇，TE buffer。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.  取0.5 g植物材料，雙蒸水洗凈，并用濾紙吸干。

2.  植物材料剪成1 cm左右碎片，放入預(yù)冷的瓷研缽中。

3.  加入液氮速冷，研磨成細(xì)粉（越細(xì)越好）。

4.  在5 ml離心管中加入抽提緩沖液2.5 mll，60℃保溫1小時(shí)。

5.  15 000 rpm，離心10分鐘。上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中。

6.  加入等體積氯-仿：異戊醇（24:1），混勻抽提至水乳膠融狀。

7. 15 000 rpm，離心10分鐘。

8.  上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中。

9.  加入2/3倍體積預(yù)冷異丙醇，-20℃保溫30 min-1 h，緩緩混勻DNA成絮狀折出。

10.  15 000 rpm，離心10分鐘，棄上清。

11.  DNA沉淀用 70％乙醇洗2次。

12.  加入400 ul TE buffer溶解DNA。

注意事項(xiàng)：真核細(xì)胞基因組較大，在操作中應(yīng)注意動(dòng)作輕柔，且在低溫下進(jìn)行，以大限度地減少機(jī)械和化學(xué)作用對(duì)DNA的剪切，從而獲得相對(duì)完整的DNA。

其他
以下幾點(diǎn)可能會(huì)有所幫助： 1. 堅(jiān)持使用2-巰基-乙醇和PVP； 2. 取幼嫩一點(diǎn)的材料； 3. 低溫； 4. 快速； 5. 酚氯-仿抽提離心后， 小心吸取上清液， 求質(zhì)量而不求數(shù)量； 6. *的一點(diǎn)技巧， 酚氯-仿抽提時(shí)盡可能充分混勻。