（一）微生物細胞大小的測定

1、目鏡測微尺的校正

把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準焦距，視野中看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微盡與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使兩尺重迭，再使兩尺的“0"刻度wan全重合，定位后，仔細尋找兩尺第二個wan全重合的刻度，計數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。因為鏡臺測微尺的刻度每格長10µm，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的實際長度。

目鏡測微尺每格長度

例如：目鏡測微尺5小格正好與鏡臺測微尺5小格重迭，已知鏡臺測微尺每小格為10µm

目鏡測微尺上每小格長度為。

用同樣方法分別校正在高倍鏡下和油鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。

由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測微尺必須針對特定的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長度）進行，而且只能在該顯微鏡上重復使用，當更換不同顯微鏡目鏡或物鏡時，必須重新校正目鏡測微尺每一格所代表的長度。刻度重合

2、細胞大小的測定

⑴將酵母菌斜面制成一定濃度的菌懸液。

⑵取一滴酵母菌菌懸液制成水浸片。

⑶移去鏡臺測微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺來測量酵母菌菌體的長，寬各占幾格，不足一格的部分估計到小數(shù)點后一位數(shù)。測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長和寬。一般測量菌體的大小要在同一個標本片上測定10～20個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。待測微生物需用培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌體進行測定。

⑷同樣方法用油鏡測定枯草桿菌染色標本的細胞大小。

（二）微生物細胞的顯微直接計數(shù)法

1、視待測菌懸液濃度，加無菌水適量稀釋（斜面一般稀釋到10－2），以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。

2、取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。

3、將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，不宜過多，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上，注意不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片，勿使產(chǎn)生氣泡。

4、靜置片刻，將血球計數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下觀察到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應適當關(guān)小孔徑光闌并減弱光照的強度。

5、計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個大方格外，還需數(shù)中央1個大方格的菌數(shù)（即80個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。

6、對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復計數(shù)2～3次，每次數(shù)值不應相差過大，否則應重新操作，求出每一個小格中細胞平均數(shù)（N），按公式計算出每mL(g)菌懸液所含酵母菌細胞數(shù)量。

7、測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干，放入盒內(nèi)保存。